蛔蟲(chóng)卵死亡率的測(cè)定

試劑：氫氧化鈉、蒸餾水、硝酸鈉、甘油、甲醛、甲醛生理鹽水。

儀器配件：玻璃珠、振蕩器、離心管、離心機(jī)、金屬絲圈、燒杯、微孔火棉膠濾膜、高爾特曼氏漏斗、彎頭鑷子、載玻片、顯微鏡、培養(yǎng)皿、脫脂棉、濾紙、恒溫培養(yǎng)箱。

（1）測(cè)定方法原理

將堿性溶液與肥料樣品充分混合，分離蛔蟲(chóng)卵，然后用密度較蛔蟲(chóng)卵密度大的溶液為漂浮液，使蛔蟲(chóng)卵漂浮在溶液的表面，從而收集檢驗(yàn)。

（2）試驗(yàn)方法

①蛔蟲(chóng)卵分離

稱(chēng)取5.0～10.0?g樣品（顆粒較大的樣品應(yīng)先進(jìn)行研磨），放于容量為50?mL離心管中，注入NaOH（氫氧化鈉）溶液25～30?mL,另加玻璃珠約10粒，用橡皮塞塞緊管口，放置在振蕩器上，靜置30?min后，以200～300?r/?min頻率振蕩10～15?min。振蕩完畢，取下離心管上的橡皮塞，用玻璃棒將離心管中的樣品充分?jǐn)噭颍�再次用橡皮塞塞緊管口，靜置15～30?min 后，振蕩10～15?min。

②離心沉淀

從振蕩器上取下離心管，拔掉橡皮塞，用滴管吸取蒸餾水，將附著于橡皮塞上和管口內(nèi)壁的樣品沖入管中，以2000～2500?r/?min速度離心3～5?min后，棄去上清液。然后加適量蒸餾水，并用玻璃棒將沉淀物攪起，按上述方法重復(fù)洗滌三次。

③離心漂浮

往離心管中加入少量飽和 NaNO3 （硝酸鈉）溶液，用玻璃棒將沉淀物攪成糊狀后，再徐徐添加飽和 NaNO3 （硝酸鈉）溶液，隨加隨攪，直加到離管口約1?cm為止，用飽和?NaNO3 （硝酸鈉）溶液沖洗玻璃棒，洗液并入離心管中，以2000～2500?r/?min速度離心3～5?min。

用金屬絲圈不斷將離心管表層液膜移于盛有半杯蒸餾水的燒杯中，約30次后，適當(dāng)增加一些飽和NaNO3 （硝酸鈉）溶液于離心管中，再次攪拌、離心及移置液膜，如此反復(fù)操作３～４次，直到液膜涂片觀察不到蛔蟲(chóng)卵為止。

④抽濾鏡檢

將燒杯中混合懸液，通過(guò)覆以微孔火棉膠濾膜的高爾特曼氏漏斗抽濾。若混合懸液的渾濁度大，可更換濾膜。

抽濾完畢，用彎頭鑷子將濾膜從漏斗的濾臺(tái)上小心取下，置于載玻片上，滴加二、三滴甘油溶液，于低倍顯微鏡下對(duì)整張濾膜進(jìn)行觀察和蛔蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。當(dāng)觀察有蛔蟲(chóng)卵時(shí)，將含有蛔蟲(chóng)卵的濾膜進(jìn)行培養(yǎng)。

⑤培養(yǎng)

在培養(yǎng)皿的底部平鋪一層厚約1?cm?的脫脂棉，脫脂棉上鋪一張直徑與培養(yǎng)皿相適的普通濾紙。為防止霉菌和原生動(dòng)物的繁殖，可加入甲醛溶液或甲醛生理鹽水，以浸透濾紙和脫脂棉為宜。

將含蛔蟲(chóng)卵的濾膜平鋪在濾紙上，培養(yǎng)皿加蓋后置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28?℃～30?℃?條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常滴加蒸餾水或甲醛溶液，使濾膜保持潮濕狀態(tài)。

⑥鏡檢

培養(yǎng)10～15?d?，自培養(yǎng)皿中取出濾膜置于載玻片上，滴加甘油溶液，使其透明后，在低倍鏡下查找蛔蟲(chóng)卵，然后在高倍鏡下根據(jù)形態(tài)，鑒定卵的死活，并加以計(jì)數(shù)。鏡檢時(shí)若感覺(jué)視野的亮度和膜的透明度不夠，可在載玻片上滴一滴蒸餾水，用蓋玻片從濾膜上刮下少許含卵濾渣，與水混合均勻，蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢。

⑦判定

凡含有幼蟲(chóng)的，都認(rèn)為是活卵，未孵化或單細(xì)胞的都判為死卵。

⑧結(jié)果計(jì)算

K=100(N1-N2)/ N1

式中：

K?—蛔蟲(chóng)卵死亡率（%）

N1—鏡檢總卵數(shù)

N2—培養(yǎng)后鏡檢活卵數(shù)